抗菌肽通过这些方式裂解杀死病毒细菌和癌细胞

抗菌肽通过这些方式裂解杀死病毒细菌和癌细胞

许多抗菌肽的一级结构、二级结构甚至高级结构已经被阐明，但其作用机制仍不太明确。对抗菌肽作用机制的研究主要集中在阳离子抗菌肽与膜作用的模式上，用荧光标记的抗菌肽和敏感染料标记的膜在整个细胞上进行研究，发现几乎所有的抗菌肽与膜相互作用，且趋向于两种作用机制：膜破裂和非膜破裂。

（一）膜裂解机制

已报道的膜裂解肽大多是冖螺旋，但并不是所有含冖螺旋的肽都是膜裂解肽。现有3 种机制被用来解释膜裂解机制，即桶状孔道模式(barrel一stave model)、毯式模式(carpet model)和环形孔道模式（toroidal pore model)。

1.桶状孔道模式

抗菌肽抗菌机制的早期研究多认为抗菌肽是通过桶状孔道模式形成细胞膜孔道而实现其杀菌作用的。抗菌肽疏水端有插人质膜的倾向，所以对该机制中抗菌肽作用模型的解释是：两性分子肽重新定位并垂直膜排列（就像在桶上穿孔一样），多个抗菌肽分子形成管束状结构，这种结构的疏水端插人细胞膜而形成孔洞，致使细胞内外渗透压发生改变，导致阳离子尤其是钾离子大量外流，最后细菌失去保护而死亡。以这种方式作用的抗菌肽分子中含有较多的仪一螺旋结构。

以此模式形成细胞膜孔道的抗菌肽需符合如下要求：1、抗菌肽以单体或多聚体的形式吸附于细胞膜；2、吸附于膜的抗菌肽在低浓度下可以彼此识别并形成多聚体，即如果它们在细胞膜表面仅以小分子的单体或寡聚体存在，则不能破坏细胞膜；在与膜作用的疏水环境中可以插人到细胞膜的疏水核心；3、单体或寡聚体的后续募集可以增大孔径。其肽一膜脂作用过程与虫蚀样孔道形成相似。

桶状孔道模式

多个抗菌肽分子插人细胞膜并垂直膜排列，形成管束状结构，其疏水端与膜的脂质结合，亲水端构成孔的内部。亲水端黑色表示，疏水端蓝色表示。

（引自：Kim A. Brodgen. Antirmcrobial Peptides：Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria？Nat Rev Microbio，2005，3（3）：238）

2·毯式模式

在“毯式”机制中，抗菌肽并不插人膜中而是平行排列成双分子层，通过其疏水氨基酸残基与膜亲和而造成膜损伤。1992年Shai等在探讨dermaseptin s的作用机制时首次提出了毯式模式，随后的研究又发现其他多种抗菌肽（如杀菌肽）亦通过这种模式破坏细胞膜，在此过程中：带正电荷的抗菌肽单体分子通过静电作用像毯子一样吸附于带负电荷的细胞膜，螺旋纵轴与质膜平行，且其亲水侧与细胞膜脂质头端相接；继之，因疏水作用仪一螺旋旋转重排至其疏水侧朝向细胞膜的疏水核心；抗菌肽分子超过一定浓度时，通过破坏细胞膜脂质排列而致其破碎，就像去污剂破坏细胞一样，故此模式又称去污剂样模式。而在细胞溶解之前，可能有一个膜脂暂时性成孔的过程（图3一3）。

与桶状孔道模式相比，毯式模式无需抗菌肽的特殊结构，也无需形成膜孔道，但需要强调的是，抗菌肽的正电荷需要分布于多肽全长，且在脂一膜作用的整个过程中抗菌肽始终与脂质头端作用而无多肽垂直重排过程。

抗菌肽并不插人膜中而是平行排列成双分子层，通过其疏水氨基酸残基与膜亲和而造成膜损伤。亲水端黑色表示，疏水端蓝色表示。

（引自：Kim A. Brodgen. Antimicrobial Peptides：Pore formers or metabolic inhibitors in bactena？Nat Rev Microbio，2005，3（3）：238）

3·环形孔道模式

此种膜裂解作用如图3一4所示。Ludtke等在研究滑爪蟾素的作用机制时提出了此种作用模式，滑爪蟾素与磷脂膜接触时形成明显的螺旋结构且其纵轴与质膜平行，其疏水侧埋人膜脂双分子层中间的疏水层，而亲水侧则与质膜的极性头端作用并暴露于溶液。在肽/ 脂比例超过一定范围时，为避免抗菌肽亲水性残基暴露于膜的疏水性骨架，抗菌肽开始自身聚集，并在多肽引起的正向曲面张力的作用下，由与膜平行方向转为透膜的垂直方向，并形成透膜孔道。透膜孔道除允许离子自由通过而形成离子流外，同时形成一过性脂质流，即：因径向弥散作用，孔道相连的两侧脂质单层的脂质头端向膜脂中间骨架快速跳跃，并参与形成透膜孔道的孔壁。孔壁由多肽仪一螺旋的亲水侧和细胞膜脂质的亲水头端组成，而且孔径较桶状孔道模式大。这是环形孔道模式与桶状孔道模式的区别所在。外来多肽的加人、透膜孔道的形成、脂质的移位造成了膜结构的紊乱，最终导致细菌死亡。

以上无论哪种机制，膜裂解的结果都是细菌细胞膜快速去极化导致细菌的快速死亡，对于大部分活性肽，整个杀菌过程不到5min现在所检测到的肽可能正好依赖于上述机制，因此某些肽可能通过桶状孔道机制作用，而某些则可能通过毯式或者环形孔道机制作用。可

-环形孔道模式

抗菌肽与磷脂膜接触时形成明显的a一螺旋结构，使孔道中的细胞膜单层脂质形成不间断的弯曲，使其纵轴与质膜平行，其疏水端埋人膜脂双分子层中间的疏水层，而亲水端则与质膜的极性头端作用并暴露于溶液，即孔壁是由多肽冖螺旋的亲水端和质膜的亲水头端组成。亲水端黑色表示，疏水端蓝色表示Image

（引自：Kim A. Brodgen. Antimicrobial Peptides：Pore formers or metabolic inhibitors

in bacteria？Nat Rev Microbio，2005，3（3）：238）

以说膜裂解本身并不是一个致死事件，因为缺乏完整质膜灾难性瓦解的证据，尚不清楚这种胞膜损伤是否能单独导致细胞死亡，还是需要其他机制或细胞内某些事件的参与。

（二）非膜裂解机制

某些抗菌肽被认为作用于胞质靶位点，其跨膜迁移通过相关胶粒聚合机制，其破坏是瞬间的且不发生膜渗透，不会导致大的膜紊乱。有些抗菌肽能抑制被膜病毒的繁殖与扩散，在抗菌肽对疱疹病毒(HSV- 1)、烟草花叶病毒(TMV)、I型人免疫缺陷病毒(HIV- 1）的研究中，发现抗菌肽可以从核酸复制到病毒颗粒包装的全过程进行干扰，起到抑制细胞内病毒复制，快速抵御病毒扩散的作用。细胞内表达抗菌肽能抑制人免疫缺陷病毒(HIV)启动子控制的基因表达，这说明抗菌肽能影响基因转录，其机制可能是通过干扰信号传导通路而间接发生的。真菌属于真核细胞，与细菌不同，具有甲壳质或纤维素构成的细胞壁，研究发现，正在萌发的真菌孢子比非萌发的真菌孢子对抗菌肽要敏感得多，因而推测真菌孢子在萌发时为抗菌肽与膜作用提供了机会。在真核细胞类似的研究中，诱导细胞凋亡、线粒体攻击作用、对细胞核染色体的影响、癌细胞骨架的断裂作用以及抑制蛋白和细胞壁合成等都被认为可能是某些阳离子抗菌肽的作用机制之一Image

1.诱导细胞凋亡

Mai等以融合抗菌肽DPI局部注射到小鼠实体瘤内，并研究DPI对肿瘤细胞株MCA20 凋亡的影响，结果发现DPI可迅速诱导肿瘤细胞株凋亡，并使肿瘤体积缩小。Chen等以抗菌肽RGD tachyplesin作用于前列腺癌细胞株TSU,以荧光免疫法和western印迹杂交法检测，结果发现凋亡相关蛋白caspase9、caspase8、caspase3以及Fas配体表达均升高，提示抗菌肽RGD tachyplesin可诱导与fas相关的凋亡，因此推测诱导凋亡可能是某些抗菌肽的作用机制之一Image

2·线粒体攻击作用

Bobek等以人唾液中提取的抗菌肽MUC7作用于临床常见的真菌、杆菌和球菌，发现 MUC7对真菌和细菌都有很强的杀伤作用。在超微结构中发现线粒体出现肿胀、空泡化、峤脱落和排列不规则，核膜界限不清，有的核破裂，内容物溢出。这提示抗菌肽MUC7的作用机制可能与抑制肿瘤细胞呼吸有关。Chen等也发现抗菌肽tachyplesin的作用机制与抑制线粒体相关的caspase7和caspase6蛋白有关。Fehlaum等发现thanatin在0．3、0，6 emol/L时，就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度提高到70pmol/L时，仍然检测不到细胞内K+的泄漏，提示thanatin不是通过形成离子通道来杀灭细菌。当利用 4嫲mol/L的thanatin处理细菌时，lh后可检测到细胞的呼吸作用变弱，6h后完全停止。

因此认为thanatin是通过抑制细胞呼吸作用来杀菌的。

3 ·对细胞核染色体的影响

以往的研究多集中于抗菌肽对细胞膜的破坏作用，但Hariton等以具有同源性的两种抗菌肽dermaseptin S4，dermaseptinS4作用于I-leLa肿瘤细胞株，荧光免疫染色发现S4不能进人到肿瘤细胞内部；S4分子量较小，可以进人到细胞内部，但不能结合到细胞核上。对其进行氨基酸序列加工改造后获得的新型抗菌肽PVS4和RRS4却具有更强的穿透性，同时也可以结合到肿瘤的细胞核上。研究发现，经这两种改造后的抗菌肽作用后的肿瘤细胞 DNA出现断裂，并最终导致死亡，由此推测抗菌肽可以通过直接作用于肿瘤细胞的染色质发挥杀伤作用。

4，对癌细胞骨架的断裂作用

Chen等研究了天蚕素B、Bl和133的抗肿瘤作用机制，这3种抗菌肽在空间结构和氨基酸序列上存在着一定差异，但又有一定的同源性。通过作用于体外培养的肿瘤细胞发现，3 种抗菌肽都可以使细胞的双分子层发生溶解，微管崩解，肿瘤细胞皱缩、死亡。并且发现这种杀伤作用的效率与3种抗菌肽的空间结构和成分密切相关，证实了抗菌肽不仅可以使细胞膜发生穿孔，而且还可以破坏微管的正常功能，影响细胞骨架的完整性，阻止纺锤丝形成和有丝分裂，进而破坏细胞器，杀伤肿瘤细胞。虽然抗菌肽对肿瘤细胞和正常人体细胞的细胞骨架均有一定损伤，但后者骨架系统完整，修复快，不会造成不可逆损伤。而肿瘤细胞骨架不完整，经抗菌肽作用后，得不到及时修复，最终导致死亡。

5，抑制蛋白质及细胞壁合成

Harder等发现人的抗菌肽HBD- 3能够抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻，并使细胞壁穿孔，最终导致细菌死亡。目前在发现抗菌肽的多种作用机制中，膜裂解理论被认为是抗菌肽的最主要作用途径，然而同一种抗菌肽也可能通过多种途径发挥作用。

（三）抗菌肽的选择性杀伤机制

抗菌肽的选择性杀伤机制一直是人们感兴趣的热点之一，原核生物和真核生物细胞膜的脂质特异性可以解释这一点。如图3一5所示，原核生物和真核生物细胞膜最主要的区别在于其脂质的组成和排列：哺乳动物细胞膜外层脂质为其所特有的呈电中性的两性磷脂，主要是卵磷脂和鞘磷脂；而细菌细胞膜则含有大量的带有负电荷的磷脂（如磷脂酰甘油和心磷脂），且有时其含量会超过50％，使其必然暴露于细胞外膜；此外，革兰阴性菌细胞壁主要由带大量负电荷的脂多糖组成。

cholesterolZWItter10111Cacidic

phospholipidsphospholipids

-原核生物和真核生物细胞膜区别模式图

弓丨自：Matsuzaki K. Molecular action mechanisms and membrane recognltion Of membrane-acting antimicrobial peptides. Yakugaku Zasshi. 1997，May；117（5）：253

通过膜与抗菌肽疏水端的疏水作用以及膜脂质所带的负电荷与抗菌肽所带的正电荷间的静电吸引作用，抗菌肽可以选择性地结合并渗透带负电荷的细胞膜。然而，起自身防御作用的抗菌肽的疏水性通常太微弱以至不足以与两性磷脂有效结合，从而防止了自身毒性。

原核生物和真核生物细胞膜的另一重要区别在于后者含有丰富的真核细胞特有的固醇类物质，例如胆固醇的存在可以使人红细胞免受滑瓜蟾素2的破坏。肿瘤细胞等病变细胞膜脂质成分或排列的改变可能是导致抗菌肽对其杀伤的关键。

总之，原核细胞和真核细胞膜间最简单的电荷区别是抗菌肽选择性杀伤且对正常真核细胞几乎无毒性或低毒性的关键所在。

本文来自于《肽营养学》   李勇教授著

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