基因工程胶原蛋白合成

基因工程与胶原蛋白

提取技术

  通过动物源提取的胶原蛋白会存在免疫性和病毒性两大问题，在操作环节提出了更高的要求，基于此，学者开始通过基因工程技术进行胶原蛋白的提取。基因工程生产的重组人源胶原蛋白，是将人体胶原蛋白基因进行特定序列设计、酶切和拼接、连接载体后转入工程细胞，通过发酵表达生产的胶原蛋白及其类似物的技术。目前已有多种通过基因工程生产重组人源性胶原蛋白的方法，各方法全面涉及到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、转基因作物等不同表达体系。基因工程提取的胶原蛋白具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点，解决动物源的安全隐患问题，同时也改善了亲水性、免疫排异性等性能。

  通过基因工程提取胶原蛋白的流程为：获取目的基因及质粒构建和扩增→菌种培养→种子培养→发酵生产→分离→均质→分离→纯化等步骤，而用基因工程提取胶原蛋白技术上的难点在于获取目的基因及质粒构建和扩增（即基因片段的选择及三螺旋结构的构建）、细胞转染、蛋白纯化等环节。

目标基因序列选择

活性胶原是由三条肽链由共价键、氢键联结在一起并且三股螺旋结构保持完整，分子量约为300kDa，分子量较大。通过基因重组获得胶原蛋白首先需要明确目的基因，一般可通过第三方进行合成或者购买。目的基因含有目标重组蛋白的基因序列，决定蛋白的氨基酸序列。重组蛋白的基因序列较易获得，而选择哪个片段进行重组则影响后续工艺流程及下游应用。根据氨基酸序列长度，将重组胶原蛋白可分为重组人胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白、重组类胶原蛋白，工业生产中多以部分氨基酸序列的重组人源化胶原蛋白为主。

每一种蛋白产品均由不同的序列组成，细胞转染是将表达特殊序列重组蛋白对应的基因序列转染到细胞的过程。不同产品的生产过程中，需将不同的基因序列转染进入细胞，从而生产出不同的重组蛋白。表达载体自身带有重组蛋白表达的关键分子原件，支持在细胞中进行目的蛋白表达。随后，将表达载体和转染试剂以一定比例混合，加入到细胞中，转染试剂与表达载体形成复合物，协助表达载体进入细胞，进行后续的蛋白表达。

提取与提纯

  基因工程提取胶原蛋白有五大表达体系。学者通过利用基因工程技术来避免动物来源病毒的风险，常见的有五大表达体系：原核细菌蛋白表达系统（大肠杆菌等）、真核酵母蛋白表达系统（毕氏酵母/酿酒酵母等）、真核昆虫细胞蛋白表达系统（被杆状病毒感染的昆虫细胞等）、真核哺乳动物细胞蛋白表达系统（CHO细胞、HEK293细胞等）、植物表达体系（烟草、番茄等）。不同的表达体系得到的重组蛋白活性、复杂程度及表达率存在差异，常根据下游应用及生产需要选择相应的表达体系。

  胶原的三螺旋结构高度依赖脯氨酸羟化酶。胶原蛋白的活性与三螺旋结构高度相关，最重要的是三条α链之间的氢键，羟脯氨酸的羟基帮助氢键形成并且提升胶原蛋白亲水性，但其是胶原蛋白原始序列中的脯氨酸在脯氨酸羟化酶作用下形成的，属于翻译后的修饰结果，而非原始编码。

  脯氨酸羟化酶的影响在于，在大肠杆菌及酵母中表达，通过基因工程得到的胶原蛋白，即使被高效转录和翻译，生成的肽链缺少羟脯氨酸，影响了胶原蛋白的三螺旋结构形成及应用功能，尤其是亲水性、生物活性、理化特征等，因而通过大肠杆菌/酵母表达得到的胶原蛋白与天然胶原蛋白存在差异。考虑到昆虫细胞及哺乳动物细胞得到的胶原蛋白与天然蛋白结构相似度高，但考虑其高成本、长周期等缺陷，难以满足产业化需求；而大肠杆菌及酵母虽有空间结构不一致的缺陷，但其具有成本低、周期短、技术相对简单的优点，成为了基因重组工业化生产的首选表达方式。大肠杆菌/酵母低成本但结构不一致，昆虫细胞/哺乳细胞结构相同但成本高昂，产物结构与生产成本的博弈构成了基因工程胶原蛋白产业化生产的难点，也成为各家厂商所亟待解决的问题。

  考虑到动物源提取的胶原蛋白具有病毒性及免疫性，而从动植物表达重组胶原蛋白的成本高、培养难度大、表达量较低，当前处于实验室阶段，微生物发酵技术则以大肠杆菌和酵母为主，通过对这两种表达体系的发酵调控进行梳理，可以挖掘基因工程获取胶原蛋白的难点。

  Ø大肠杆菌：pH值、温度、溶解氧、葡萄糖和氮是影响重组胶原蛋白表达量及菌体生长的重要因素，过高或过低均不利于发酵产物的表达，需选择合适的生长条件。乙酸是大肠杆菌发酵过程的副产物，会抑制细胞生长和胶原蛋白生成，乙酸的浓度与葡萄糖浓度相关，乙酸去除过程伴随着营养物质的损失，可通过大肠杆菌同化乙酸来控制乙酸含量。二氧化碳对微生物细胞的生长和生产会有抑制或促进作用，与溶解氧相关，二氧化碳的浓度以及注入时段均影响着发酵产物的表达以及菌体的生长。分离提纯过程中，重组蛋白在胞内表达，需要将细胞破碎使胞内物质释放，再进行上清液的处理。

  Ø酵母：酵母具有强好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，有利于大规模工业化生产，发酵产物无毒副作用，纯化过程较为方便。与大肠杆菌发酵不同的是，甲醇流加不足或过量都会影响到毕赤酵母表达外源蛋白的水平，因此控制甲醇流加是提高外源蛋白表达量。另外，温度、pH和溶解氧等因素均影响胶原蛋白的表达量及菌体浓度。分离纯化过程中，重组胶原蛋白可能是胞内表达或者是分泌表达，分泌表达时目的蛋白存在于发酵液中，可直接对发酵液上清进行处理。

  重组胶原由细胞表达和分泌得来，不同的工艺和技术参数下，单位培养体积产出的产品质量可能有较大差异。通过大肠杆菌及酵母提取重组胶原蛋白后，分离提纯环节必不可少，该环节与动物源提取的方式基本一致，参考重组蛋白的上清收集、胶原纯化及检测环节的成本占比达40%，预计重组胶原蛋白的分离提纯过程中的成本占比整体较高。

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