地龙蛋白的功效与作用:抗炎、镇痛、解热作用

  地龙蛋白的功效与作用:抗炎、镇痛、解热作用

  地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier)、通俗环毛蚓P. vulgarisChen、威廉环毛蚓P. guillelmi (Michaelsen) 或栉盲环毛蚓P. pectinifera Michaelsen的干燥体[1]。始记于《神农本草经》，在我国已有悠久的使用历史，其性寒，味咸，归肝、脾、膀胱经，具有清热止痉、平肝熄风、通经活络、平喘利尿的功效；用于治疗高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肺热喘咳、尿少水肿、高血压等症[2]。

  现代研究表明，地龙化学成分主要有氨基酸、蛋白质、多肽、核苷、有机酸、脂质等[3]。其中蛋白多肽类成分质量分数高达55%～68%[3]，具有抗凝血、降压、抗菌、抗脑卒中、神经保护等多方面的药理作用，因此受到人们的广泛关注。检索国内外文献发现，自1983年以来，针对地龙的综述性文章已有46篇，这些文章主要集中在地龙的小分子化学成分、药理作用及临床研究方面[5]。虽然Verma等[6]、袁渊等[7]、杨新等[8]对地龙部分蛋白类成分进行了药理作用方面的综述，但是缺乏对地龙蛋白多肽类成分的系统总结，故本文对地龙中的蛋白多肽类成分及其药理作用进行全面综述，旨在为地龙中该类成分的进一步研究与开发利用提供参考。

1、地龙及其近缘品蛋白多肽类成分

  1983年，Mihara等[9]首次从地龙提取物中发现了具有纤溶酶活性的蛋白质，从而拉开了地龙蛋白多肽类成分研究的序幕，并于1991年从粉正蚓Lumbricus rubellus Hoffmeister中分离得到6个单多肽链蛋白，统称为蚓激酶lumbrokinase[10]，分别为F-III-1（1）、F-III-2（2）、F-II（3）、F-I-2（4）、F-I-1（5）和F-I-0（6），这些蛋白的氨基酸组成中，含有丰富的天冬酰胺和天冬氨酸，研究表明这些酶属于碱性胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶[11]。其后，该团队又从粉正蚓中分离得到一个蛋白（7）[12]，并测定了其N端序列。Yang等[13]从赤子爱胜蚓Eisenia foetida Savigny中分离得到一种纤维蛋白溶解酶（Mr＝4.5×104），该酶由2个亚基（Mr＝2.6×104和Mr＝1.8×104）通过疏水相互作用结合在一起，并对大亚基（8）的N末端序列进行了分析。Lassegues等[14]通过多克隆抗菌肽血清筛选cDNA文库，克隆了编码fetidin（9）的cDNA，并使用Intelligenetics软件包和在线MIPS软件包将核苷酸和氨基酸序列与EMBL和wiss-Prot数据库中的条目进行比较，最终确定fetidin的氨基酸序列。Cho等[15]从地龙裂解物中分离得到了6种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶F1～F6（10～15）。Verma等[16]从P. posthumousVaillant中分离得到了一个相对分子质量为2.95×104的纤溶蛋白酶（16），该酶具有广泛的底物亲和力和稳定性。

  国内学者程牛亮及其团队率先开展了地龙蛋白多肽类成分的研究，该课题组从正蚓科双胸蚓属Bimastos中分离得到多个相对分子质量为2×104～3×104的纤溶酶[17-18]，同时也从赤子爱胜蚓中分离得到含有多个二硫键的EWD1（17）、EWD2（18）和EWD3核酸酶样蛋白[19-20]。茹炳根课题组从赤子爱胜蚓中分离得到1种相对分子质量为3.3×104的纤溶酶（19）[21]，之后又从赤子爱胜蚓中分离得到同时兼具抗肿瘤和纤溶酶活性的蛋白酶ARSP1（20）[22]。有文献报道，从赤子爱胜蚓中分离得到了7种纤溶酶，分别为EFE-a（21）、EFE-b（22）、EFE-c（23）、EFE-g（24）、EFE-d（25）、EFE-e（26）和EFE-f（27），测定了EFE-a和EFE-b的晶体结构，并对EFE-a的结构进行深入分析，从结构的角度解释了该类酶的双重纤溶活性的机制[23-26]。赵锐等[27]从赤子爱胜蚓中分离到一组等电点（pI）在3.0～4.0的酸性蛋白（28～31）。值得一提的是，张汶婕等[28]首次从赤子爱胜蚓中发现了相对分子质量小于2×104的纤溶酶F1（32）和F2（33），同时，二者还具有较广的抗菌谱。

  Lumbricin（34）是一种新的富含脯氨酸的抗菌肽，由Cho等[29]首次从粉正蚓中分离得到。张希春等[30]从赤子爱胜蚓中分离得到2个抗菌肽，分别为F-1（35）和F-2（36）。Liu等[31]也从赤子爱胜蚓中分离得到了1个新的抗菌小肽OEP3121（37）。Li等[32]首次对威廉环毛蚓皮肤分泌物进行了分离，并得到新的抗菌肽lumbricin-PG（38）。

  除了从地龙中发现一些具有纤溶酶活性和抗菌活性的蛋白之外，国内外学者也发现了一些具有其他活性的蛋白多肽类成分。Oumi及其团队分别在1994年和1995年从赤子爱胜蚓和P. vittata Megascolecidae中分离得到了具有促进肠道收缩活性的annetocin（39）、GGNG-1（40）、GGNG-2（41）和GGNG-3（42）、Pheretima tetradecapeptide（43）和Eisenia tetradecapeptide（44）等多肽类成分[33-35]。VQ-5（45）和AQ-5（46）是2个具有镇痛和抗炎活性的多肽，由Li等[36]首次从从赤子爱胜蚓体腔液中分离得到。Park等[37]从Eisenia Andrei Bouché中分离得到1种纤维素酶Ean-EG（47），该酶在Eisenia andrei体内分布广泛，推测Ean-EG不仅在酶解中发挥作用，而且在固有免疫方面也有一定作用。目前从地龙及其近缘品中已发现的蛋白多肽类成分见表1。

  从表1中可以看出，地龙蛋白多肽类成分已有较多的研究。从氨基酸序列来看，目前仅确定了多肽类成分的氨基酸序列，而蛋白类成分的氨基酸序列并未完全确定，仅鉴定了其N端序列。通过氨基酸序列比对，不同课题组得到了功能相近的同源蛋白，如F-III-1（1）、F-III-2（2）、EFE-g（24）、F5（14）、F6（15）、EFE-b（22）、EFE-c（23）等具有相似的N端序列；从活性的角度来看，高相对分子质量的蛋白类成分具有抗凝、溶栓的作用，而低相对分子质量的多肽类成分则具有抗菌、促进肠道收缩等作用；从来源来看，目前地龙蛋白多肽类成分的研究主要集中在非药典来源的赤子爱胜蚓和粉正蚓。

2  地龙及其近缘品蛋白多肽类成分药理作用

  2.1  对心血管系统的作用

  2.1.1  抗凝血、抗血栓  研究发现，地龙中含有的蚓纤维蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓胶原酶等具有很好的抗凝血、促进纤溶蛋白溶解、改善血液循环等作用[39]。它们可以直接作用于纤维蛋白原和纤维蛋白，也可以通过激活纤溶酶原而发挥作用。另外，地龙中的这些酶还能够抑制血小板聚集，促进组织型纤溶酶原激活物的分泌，以及水解凝血酶[8]。段平等[40]通过实验发现地龙中的纤溶酶抗凝血效果具有剂量相关性，低剂量时能够降低纤维蛋白原水平和延长凝血酶时间，高剂量时能在此基础上延长凝血酶原时间和白陶土部分凝血活酶时间，并且还能够降解凝血因子II、VIII，从而产生强效抗凝的效果。

  2.1.2  降压  李承德课题组对地龙耐热蛋白LHP在降压方面的作用进行了深入研究，发现LHP对正常大鼠和自发性高血压大鼠（SHR）均有显著降压作用，LHP能够升高血浆、肾脏局部6-酮-前列腺素-F1a的含量，抑制SHR肾脏血管紧张素1型受体（AT1）受体的表达，降低血浆、肾脏血管紧张素II、内皮素及醛固酮的含量[41-42]。肖梅芬[43]制备得到1种具有降糖、降压、消除糖尿病并发症的地龙蛋白，研究发现该蛋白能够通过溶解血栓及改善血管状态而发挥降压作用。临床实验发现，该蛋白能够使原发性高血压病患者血压控制在正常水平，使重度高血压或心脑血管并发高血压患者服用其他降压药的效果增强，从而减少其服药剂量及毒副作用。

  2.2  对神经系统的作用

2.2.1  抗缺血性脑卒中  

  根据缺血性脑卒中的特点，临床上主要有2种治疗方案：一是通过溶栓、扩张血管、调节血液状态等改善脑缺血区域供血[44]；二是通过阻断神经细胞死亡，减轻神经细胞损伤，保护神经细胞结构和功能，促进受损伤神经细胞恢复等方式达到神经保护的目的[45]。

  地龙中的蚓激酶（LK）具有类似纤溶酶原激活物的作用，能够使缺血性脑卒中患者纤维蛋白含量下降，从而抑制血栓形成，减小脑梗死面积，改善脑缺血区供血[46]。Ji等[47]对LK抗脑缺血作用机制进行研究，发现LK能够升高环磷酸腺苷（cAMP）水平，减少钙离子从钙库释放，还能够抑制细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达从而起到抗血小板聚集以及抗血栓形成的作用，另外LK还能够激活JAK1/STAT1通路产生抗细胞凋亡、保护脑缺血损伤的作用。临床上通过多中心、双盲、安慰剂对照的试验也证实了LK在缺血性脑卒中治疗及康复过程中具有良好的疗效[48]。除LK外，Kim团队对地龙中的1种抗菌肽lumbricusin在神经系统方面的作用也进行了深入研究，发现lumbricusin能够促进神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖，抑制6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的小鼠神经干细胞（MNSCs）细胞凋亡，并且在小鼠帕金森病（PD）模型中显示出神经保护作用，其作用机制可能是促进p27[Kip1]降解[49-50]。Seo等[51]基于lumbricusin的氨基酸序列新合成得到1种多肽LumA5，研究发现该多肽能够抑制脂多糖（LPS）引起的小胶质细胞活化，从而改善神经炎症，此外，LumA5还能够抑制由LPS活化产生的对神经元细胞SH-SY5Y的细胞毒性并改善其细胞活力。这些研究均显示地龙中蛋白多肽类成分在神经系统中可能有多方面的效果，值得进一步研究开发。

2.2.2  抗癫痫 

  癫痫是一种神经系统综合征，具有突然发生、反复发作的特点。中枢神经系统内的抑制性氨基酸和兴奋性氨基酸之间平衡失调是导致癫痫发作的重要原因，而γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（Glu）分属于这2种氨基酸[52]。研究发现地龙中LK能够提高GABA水平，并同时降低Glu含量，从而改善抑制性氨基酸和兴奋性氨基酸神经递质的平衡失调，产生与丙戊酸钠相仿的抗癫痫效果，并且随着LK剂量的增加，其作用呈现出优于后者的趋势[53]。

2.3  止咳平喘作用

   临床资料显示[54-55]，鲜地龙提取液能够快速治疗哮喘急性发作，改善呼吸困难症状和肺功能。房泽海等[56-57]从赤子爱胜蚓中提取分离得到一种粗蛋白EP，豚鼠哮喘模型整体实验表明EP具有良好的平喘活性，能够预防抗原攻击后引起的动态肺顺应性下降和肺阻力增高。对EP进一步分离纯化得到的活性蛋白成分EP2，研究发现EP2在整体和离体动物实验中均表现出良好的平喘效果，作用强度与孟鲁司特接近。可以看出，地龙蛋白是地龙平喘作用的物质基础之一，但是其平喘蛋白的具体结构以及作用机制还有待进一步研究。

2.4  免疫增强作用

  QY-I是从太平II号蚯蚓Eisenia foelide中分离得到1种糖蛋白，研究发现该蛋白能够显著提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能[58]。唐小云等[59]分离得到1种小分子活性多肽LP，研究发现LP能够明显提高淋巴细胞增殖率和巨噬细胞及脾细胞分泌NO的水平，还能够增强巨噬细胞毒效应。郭建等[60]研究了地龙活性蛋白对免疫造血功能的影响，发现地龙活性蛋白对B淋巴细胞（BC）反应和淋巴细胞的转化具有促进作用，还能够增强巨噬细胞的吞噬功能，从而提高机体的免疫力。

2.5  抗肿瘤作用 

  体内外实验均证明地龙提取物对多种肿瘤有明显的抑制作用，其抗肿瘤成分主要为蛋白类成分[61]。赵锐等[27]从地龙中分离得到一组活性蛋白D2(8)，通过体外肿瘤细胞抑制实验证明D2(8) 具有抗肿瘤活性，并推测其对肿瘤细胞的作用可能与丝氨酸蛋白酶水解肿瘤细胞中某些结构蛋白，破坏肿瘤细胞结构完整性有一定的联系。陈学东等[62]从背暗异唇蚓Allolophoracaliginosa Duges中分离得到一组相对分子质量在3 000～5 000的蛋白成分，动物实验发现该组蛋白能够抑制基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达，从而明显降低瘤体的体积与质量。林少琴等[63]从地龙中分离得到一组具有清除自由基、抗脂质过氧化的糖蛋白，研究发现该组蛋白能够通过增强小鼠免疫功能，从而抑制肿瘤细胞的生长。Hrzenjak等[64]从地龙中提取得到一种糖脂蛋白混合物，发现其具有抗氧化作用、类似纤溶酶和抗氧化酶活性，并推测其具有较强的抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡的作用[64]。郭建等[60]通过实验推测地龙活性蛋白对免疫系统的作用可能是其抗癌作用的相关环节。刘松江等[65]观察地龙蛋白提取液对小鼠结肠癌移植瘤生长及血管新生的抑制作用，并探索相关分子机制，发现地龙提取液对小鼠结肠癌移植瘤的生长及血管新生有显著抑制作用，该作用可能与其抑制JAK-STAT3通路有关。谢江碧等[66]研究发现地龙提取物对多种人癌细胞株有抑制杀伤作用，其中凋亡相关丝氨酸蛋白酶I是地龙抑制癌细胞生长的物质基础。常春霞[67]对地龙纤溶酶抗肝癌转移作用进行研究，发现地龙蛋白具有类似纤溶酶原激活物的作用，能够使肿瘤患者血液高凝的状态得到改善，从而有效减少肿瘤发生转移的风险。

2.6  抗纤维化作用

  研究发现地龙2号（主要成分为蚯蚓纤溶酶及蚯蚓胶原酶）具有抗肝纤维化作用，能够抑制CCl4诱导的大鼠肝内纤维组织的形成、减轻肝细胞的损害、降低血中透明质酸及黏连蛋白的含量，进一步研究发现地龙2号能下调肝脏细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1、尿激酶型纤溶酶原激活物、I型纤溶酶原激活抑制物、基质金属蛋白酶组织抑制物-1水平；上调基质金属蛋白-13 mRNA和蛋白表达水平，并促进细胞外基质降解，从而抑制肝星状细胞的活化，对抗纤维化形成[68-69]。Yang等[70]研究发现地龙提取物（主要为蚓激酶）能够显著减少肺部炎症和纤维化，并且改善SiO2灌注小鼠的肺结构和功能。其作用机制为抑制人支气管上皮样细胞HBE和人肺癌A549细胞中的SiO2诱导的氧化应激、线粒体凋亡途径和上皮间质转化。此外，还发现核因子E2相关因子2（Nrf2）激活部分介导了地龙提取物对SiO2诱导的肺纤维化的干预作用。其研究说明地龙提取物是一种潜在的具有抗氧化、抗炎和抗纤维化的用于矽肺治疗的药物。Lai等[71]发现蚓激酶能抑制暴露于二手烟所引起的心脏纤维化，具有心脏保护作用，可有效防止暴露于二手烟的非吸烟者心脏疾病的流行病学发病率。地龙中具有抗纤维化的蛋白成分，多为具有抗凝、溶栓作用的酶类成分，其抗纤维化的作用机制与其抗凝、溶栓作用有可能存在一定的联系。

2.7  抗炎、镇痛、解热作用

  临床上发现鲜地龙提取物能够加速伤口的恢复，减少炎症物质的渗出，缩短炎症期，推测其良好的抗炎能力可能与其增强巨噬细胞的免疫活性有关[72]。Balamurugan等[73]从蚯蚓中分离得到1种类似于糖蛋白复合物的物质EE，该物质具有与吲哚美辛及扑热息痛相似的抗炎和解热功效，能够使炎症和发热大鼠的组胺呈剂量依赖性降低，并恢复正常状态。Seo等[51]基于地龙抗菌肽lumbricusin的氨基酸序列新合成得到1种多肽LumA5，该多肽能够显著降低酶如环氧合酶-2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS），细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和信号转导因子如蛋白激酶B（AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、核转录因子-κB（NF-κB）参与LPS引发的体内外炎症反应。Li等[36]分离得到镇痛肽VQ-5（45）和抗炎肽AQ-5（46），它们能够在持续性神经性疼痛和炎症小鼠模型中表现出镇痛活性，并能够抑制参与镇痛和抗炎功能的MAPKs信号通路。地龙蛋白多肽类成分的抗炎活性是其具备其他药理作用的基础，如止咳平喘作用、抗肿瘤作用以及对神经系统的作用等。

2.8  抗菌作用

  地龙生活在土壤中，经过长期的进化已经形成了抵抗外来微生物侵袭的机制，自身能够产生一些抗菌类成分。Cho等[29]分离得到的抗菌肽lumbricin I（34），具有广谱的抗菌活性，且没有溶血副作用，说明该肽可能为地龙的防御系统的组成成分。张希春等[30]分离得到的抗菌肽F-1（32）和F-2（33），对革兰阳性菌、阴性菌和真菌都有一定抑制作用。崔东波等[74]从地龙中分离得到了1种抗菌肽，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等10多种菌均有不同程度的抑制作用。Li等[32]分离得到的抗菌肽lumbricin-PG（38）对细菌和真菌具有潜在的抗微生物活性，但表现出对人和兔红细胞的弱溶血活性。在当前抗生素使用泛滥、抗药性细菌不断增多的背景下，基于仿生学，对来源于地龙抗菌活性多肽类成分的深入研究，将有助于新的抗生素的发现。

2.9  加速创面愈合作用

  Deng等[75]通过宏观、组织病理学、血液学和免疫组织化学证明鲜地龙匀浆提取物具有促进伤口愈合的作用，并推测其潜在的机制可能是加速羟脯氨酸和转化生长因子-β（TGF-β）分泌，从而增加胶原蛋白的合成，促进毛细血管和成纤维细胞的增殖。

  Grdisa等[76]通过测量健康皮肤、生理愈合伤口和用地龙糖蛋白G-90处理的伤口中表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）的活化程度，发现G-90能够明显促进EGF、FGF的产生。Matausijć-Pisl等[77]进一步研究G-90对动物伤口模型的影响，发现G-90比阳性药panthenol D能够更好地促进伤口愈合，并具有抗菌、抗炎效果。Goodarzi等[78]同样发现G-90能够促进糖尿病大鼠的伤口愈合，故一致认为G-90能够成为一种新型伤口愈合剂。Yang等[79]对G-90进一步分离得到3个组分，其中ES2能够促进成纤维细胞和角质形成细胞的增殖以及刺激创伤区域中成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的表达，从而表现出显著的创伤愈合能力。Song等[80]研究发现地龙活性蛋白EAP可有效促进NIH3T3细胞的增殖和迁移活性，其促进增殖活性是通过PI3K→Rac→PAK→MEK信号通路实现的。

2.10  地龙蛋白其他作用

  Pan等[81]研究发现地龙消化道中的1种蛋白酶Eisenia fetidaprotease-III-1（EfP-III-1）具有DNA酶和蛋白酶双重活性，且其活性具有pH依赖性，在碱性条件下表现出蛋白酶的作用；在酸性条件下表现出DNA酶活性；在pH 7.0时2种活性均具备。鉴于蚯蚓复杂的生活环境，EfP-III-1的这种双重活性可能在蚯蚓的消化道中发挥重要作用。Ueda等[38]从赤子爱胜蚓的体腔液中纯化出1种新蛋白酶（48），研究发现该蛋白酶对黄瓜花叶病毒（CMV）和番茄花叶病毒（TMV）具有强抗病毒活性，可作为抗CMV、TMV和其他植物病毒的潜在抗病毒因子。

3  地龙蛋白肽功能与作用总结

  中药地龙资源丰富，其蛋白多肽类成分含量高、毒性低，具有多方面的药理作用，国内外学者对地龙蛋白多肽类成分的研究也日益深入和广泛，并开发出多种地龙蛋白多肽类产品，如地龙活性蛋白胶囊、地龙蛋白溶血栓胶囊、蚓激酶肠溶胶囊、多肽地龙蛋白等，这些产品都已应用于临床，并越来越多地在心脑血管、呼吸系统等疾病的预防和治疗中发挥作用。

  但是地龙蛋白多肽类成分复杂，针对其研究也存在一些问题。首先，目前分离纯化并确定氨基酸序列的蛋白多肽类成分较少，测定了空间结构的更是微乎其微，因此在传统分离的基础上，结合化学合成及基因重组的方法将有助于地龙蛋白多肽类成分氨基酸序列的解析，也为地龙蛋白多肽类成分空间结构的解析打下基础；其次，地龙蛋白多肽类成分的活性研究目前多集中于提取物及提取部位的活性测定，因此，蛋白多肽单体成分的活性及其机制研究显得尤为迫切。

  本文通过对中药地龙蛋白多肽类成分及其药理作用研究进展进行了综述，为地龙蛋白多肽类成分的进一步研究与开发提供参考。

参考文献（略） 

来  源：刘  巧，毕启瑞，谭宁华. 地龙蛋白多肽类成分的研究进展 [J]. 中草药, 2019, 50(1):252-261.

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